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发布时间:2022-02-09 19:33:29
材料与方法
一、材料
AFP购自上海领潮公司。SP2/0骨0髓瘤细胞(中科院上海细胞库)。8~12周龄Balb/c小鼠(第四军0医大学实验动物中心)。SPF级。
二、方法
1.动物免0疫:将4只8~12周龄Balb/c小鼠随机分为两组,每组2只,分别命名为1号和2号(第yi组)、3号和4号(第二组)。第yi组按常规免0疫方法进行免0疫一…,第二组采用改良的免0疫方法进行免0疫。免0疫前静脉采集少量血液,析出血0清作为后续检测的阴性对照血0清。
第yi组:AFP50ug(50肚1)与等量福氏完全佐剂(Sigma,美国)混合,充分乳化后注入8~12周龄Balb/c小鼠腹腔,2周后用同量抗原加不完全福氏佐剂(Sigma,美国)腹腔***,4周后用同量抗原加不完全福氏佐剂腹腔***,融合前3 d作腹腔***加强免0疫。
由于改良免0疫法只需二次基础免0疫而常规免0疫法则需要2倍于改良法的免0疫次数,所以改良法抗原用量明显少于常规法,从而大大减少了实验成本的消耗。
此外,本实验通过对比两种免0疫方法的细胞融合率及抗0体阳性率,发现改良免0疫法均显著高于常规免0疫法。
经过后续实验,证明改良法免0疫小鼠的杂交瘤细胞经二次克0隆化后,抗0体阳性率可达检测孔的90%以上。杂交瘤细胞体外连续传代培养,并冻存复苏后仍具有分泌AFP—McAb的能力,并经染色体计数结果表明已成功获得一株AFP—McAb细胞株。这表明改良法与常规方法具有同样的有效性和稳定性。
动物免0疫
使用 quickantibody 作为免0疫佐剂,对小鼠腿部肌肉***免0疫,MRJ 重组蛋白( 1 μg /mL) 与免0疫佐剂各200 μL 混匀免0疫 6-8 周龄 BALB / c 小鼠 4 只,每只*** 100 μL。初次免0疫后第 21 天同样的方法进行第二次免0疫,第 35 天尾静脉取少量血做效价检测,间接 ELISA 检测效价滴度高于 1 ∶ 8 000 则进行冲击免0疫,冲击免0疫直接以不加佐剂的 MRJ 蛋白对小鼠冲击免0疫一次,每只 20 μg。冲击免0疫后 96 h 内取脾0脏细胞做细胞融合。
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在McAb的研制过程中,动物免0疫是McAb制备过程中的关键步骤。但是传统动物免0疫方式通常需要二个月左右,不但耗时长,而且抗原消耗的量大、对抗原纯度要求高。本实验试图通过优化传统免0疫小鼠的方法,大大缩短动物免0疫时间并减少了抗原的消耗量,为进一步组装患者肿0瘤***及血0清中AFP水平检测的***盒打下良好的基础,为临床研究、肿0瘤的诊治提供更为有效的_丁.具。
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